Staining technique
जब wet proparation का अध्ययन Bright field micro - scopy द्वारा किया जाता हैं। तब उस preparation मे micro - organism का अध्ययन स्पष्ट रूप से नही कर पाते है। क्योंकि micro - scope की field तीव्र प्रकाशित होती है। और micro - organism इतनी light abscrb नही कर पाते है, जिसमे वे धुंधले दिखाई देते है, परन्तु जब इन micro - organism को किसी dye के द्वारा stain किया जाता हैं। तब उनकी light absorbing ability बढ़ जाती हैं। और colour differentiation के कारण हम micro - organism का अध्ययन आसानी से कर सकते है।micro - organism को इस तरह microbiological stains के द्वारा stain करने की क्रिया को ही staining करते है।
Micro - organism की staining के लिए अनेक coloured organic compounds उपलब्ध हैं। और इन compounds को केमिकल behaviour के आधार पर विभाजित किया जाता हैं।
जैसे - Acid, Basic, Neutral, Acid dye के आयंस निकोटीन बेसिक डाई के आयंस एसिटिक व न्यूट्रल डाई के आयंस Complex Salt है। Acid dye acidic cell compounds को stain करने का कार्य करती हैं। Stain की क्रिया मे Stain of surface की active sites के बीच lon axchange की क्रिया होती हैं।
कुछ प्रमुख Staining techniques निम्न है :-
1. ग्राम स्टेनिंग
2. एसिड फॉस्ट स्टैनिंग
3. एण्डोस्पोर स्टैनिंग
4. केप्सल स्टैनिंग
5. फ्लेजिली स्टैनिंग
6. साइटोंप्लास्मिक इंट्यूसन स्टैनिंग
7. Giemsa Staining.
1. Simple Staining : -
Bacterial के fixed smear को जब Staining के Single Solution के द्वारा Color किया जाता है, तो इसे Simple Staining कहते है। इस Staining मे fixed smear को एक निश्चित समय के लिए dye solution के संपर्क मे रखा जाता है। Extra solution को slide से हटाने के लिए उसे alcohol या थोड़े से पानी से धो लिया जाता है। इस प्रकार microorganisms stain में जाते हैं और cell को क्रिस्टल वॉयलेट (christal violet ), मेथिलाइन ब्लू (methelene blue ),(phychosine )फाइको साइन आदि द्वारा होती हैं।
2. Differential staining :- Bacteria cell के बीच अंतर (difference) देखने के लिए जिस स्टेनिंग टेक्निक का उपयोग किया जाता है उसे Differential staining कहते हैं। यह स्टेनिंग सिंपल स्टेनिंग की तुलना में कुछ विस्तृत है।
Differential staining techniques के अंतर्गत उनकी staining techniques आती हैं जिनके द्वारा cell एवम other cell organism का अध्ययन अच्छी तरह से कर सकते हैं।
* Types of Differential staining techniques :-
(1) Gram staining :- microbiology में एक महत्वपूर्ण अत्यधिक उपयोग की जाने वाली Differential staining के बारे में सबसे पहले क्रिश्चियन ग्राम (christian gram) ने 1884 में बताया था । इस प्रक्रिया में बैक्टीरिया को क्रम से स्टेनिंग reajent में भिगोया जाता है।
जैसे : - क्रिस्टल वॉयलेट ,आयोडीन सॉल्यूशन, एल्कोहल, सेफ्रेनिन या कुछ अन्य counter stain .
Gram staining विधि के द्वारा staining bacteria को दो group में बाटा गया है -
(A) Gram positive bacteria :- gram positive bacteria को cristal वॉयलेट से Staining लेते है। और गहरे Voilet colour के दिखाई देते है। Gram positive bacteria कहलाते है।
(B) Gram Negative Bacteria :- ग्राम नेगेटिव बैक्टेरिया, क्रिस्टल वॉयलेट से Staining नही देते है। ये counter Stained होकर Red Pink colour मे दिखाई देते है। संभवत ऐसे बैक्टेरिया के Cell Wall के composition stracture के कारण होता है।
Gram Negative bacteria को Cell - Wall gram positive bacteria की तुलना मे पतली होती है। Gram positive bacteria से gram negative bacteria मे अत्यधिक मात्रा में liquid contain करता है।
जब Alcohol fermantation किया जाता हैं। तब gram negative bacteria की cell Wall की permiability या parosity बढ़ जाती है। और क्रिस्टल वॉयलेट, आयोडीन कॉम्पलेक्स बाहर आ जाता है। जिसमे ग्राम निगेटिव बैक्टेरिया रंगहीन हो जाता है। तथा अब cell counter stain safranin से stain होता है। जबकि gram positive bacteria मे alcohol treatment पर Cell - Wall की permiredune हो जाती है। और cristal voilet iodine Complex बाहर नही आ पाता है। अब उसकी Cell Voilet colour की ही बनी रहती है। gram staining bacteria को stain करने की सबसे महत्वपूर्ण विधी है। तथा यह Staining technique micro - organism को other group जैसे – प्रोटोजोआ, सालमोनेला अनुपयोगी है।
Gram Staining के अतिरिक्त अन्य अनेक Staining technique है। जिनके द्वारा Cell Structure के particular feature या Composition को identifey किया जा सकता है। कुछ staining technique इस प्रकार हैं –
(2.) Acid F Staining : - इसे सर्वप्रथम Robest koach ने दिया। इसके द्वारा Bacteria दो समूह में विभक्त होते है –
(A) Acid fast bacteria
(B) Non acid fast bacteria.
Acid fast organism वे होते है जिन्हे stain करना कठीन होता है और एक बार stain होने पर उन्हें एसिड या alcohol से deneturise करना कठीन होता है।
उदाहरण - mycobacterium ,nocardia.
(3) Endospore stain :- Bacteria में spore व spore संरचनाओं का डेमोंस्टेशन करता है।
(4) Capsule stain :- cell के चारो ओर पाए जाने वाले capsule को demostrate करता है।
(5) Flagella stain :- Flagella के arrangement व उपस्थिति को demostrate करता है।
(6) Cytoplasmic inclusion stain :- यह stain के intra cellular deposits , glycogen, polyphosphate, hydroxy butyrate व substances को identify करता है।
(7) Giemsa stain :- इसके द्वारा मुख्य रूप से rickettsias और कुछ protozoa को stain किया जाता हैं।
