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**Restriction Endonuclease, DNA Ligase, DNA Polymerase & Polynucleotide Kinase – Functions, Types & Applications in Genetic Engineering & Biotechnology.**

Klenow एंजाइम, जिसे Klenow फ्रैगमेंट भी कहा जाता है, Escherichia coli (E. coli) बैक्टीरिया के डीएनए पोलीमरेज़ I का एक बड़ा प्रोटीन खंड है। यह एंजाइम डीएनए संश्लेषण और प्रूफरीडिंग (3'→5' एक्सोन्यूक्लिएज़) गतिविधियों को बरकरार रखता है, लेकिन इसमें 5'→3' एक्सोन्यूक्लिएज़ गतिविधि नहीं होती है। ​

Klenow एंजाइम के उपयोग:

  • डीएनए के 5' ओवरहैंग्स को भरना: यह एंजाइम 5' ओवरहैंग्स को भरकर ब्लंट एंड्स बनाता है, जो क्लोनिंग प्रक्रियाओं में सहायक होते हैं। ​

  • रैंडम-प्राइम्ड डीएनए लेबलिंग: यह एंजाइम डीएनए अणुओं को लेबल करने के लिए उपयोग किया जाता है, जिससे डीएनए प्रोब्स का निर्माण होता है। ​

  • डीएनए अनुक्रमण (सीक्वेंसिंग): Klenow एंजाइम का उपयोग सैंगर विधि द्वारा डीएनए अनुक्रमण में किया जाता है। ​सीडीएनए (cDNA) की दूसरी स्ट्रैंड संश्लेषण: यह एंजाइम cDNA की दूसरी स्ट्रैंड को संश्लेषित करने में सहायक होता है। 

विशेषताएं:

  • 5'→3' डीएनए पोलीमरेज़ गतिविधि: यह एंजाइम डीएनए स्ट्रैंड में न्यूक्लियोटाइड्स जोड़ता है।​

  • 3'→5' एक्सोन्यूक्लिएज़ (प्रूफरीडिंग) गतिविधि: यह एंजाइम गलत तरीके से जुड़े न्यूक्लियोटाइड्स को हटाकर डीएनए की शुद्धता सुनिश्चित करता है।​

यदि 3'→5' एक्सोन्यूक्लिएज़ गतिविधि अवांछित हो, तो जीन में म्यूटेशन द्वारा इसे हटाया जा सकता है, जिससे exo-Klenow फ्रैगमेंट प्राप्त होता है, जो केवल 5'→3' पोलीमरेज़ गतिविधि रखता है। ​

Klenow एंजाइम के अनुप्रयोग:

  • डीएनए ब्लंटिंग: 5' ओवरहैंग्स को भरकर ब्लंट एंड्स बनाना।​

  • डीएनए लेबलिंग: डीएनए अणुओं को लेबल करना।​

  • डीएनए अनुक्रमण: सैंगर विधि द्वारा डीएनए अनुक्रमण।​

  • सीडीएनए संश्लेषण: cDNA की दूसरी स्ट्रैंड को संश्लेषित करना।


डीएनए लिगेज़ (DNA Ligase) क्या है?

डीएनए लिगेज़ (DNA Ligase) एक एंजाइम है जो डीएनए के टूटे हुए टुकड़ों (fragments) को जोड़ने का काम करता है। यह विशेष रूप से फॉस्फोडाइएस्टर बॉन्ड (phosphodiester bond) बनाकर डीएनए के रिपेयर (मरम्मत), पुनर्संयोजन (recombination) और प्रतिकृति (replication) में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है।

डीएनए लिगेज़ के प्रकार

मुख्य रूप से दो प्रकार के डीएनए लिगेज़ पाए जाते हैं:

  1. डीएनए लिगेज़ I (DNA Ligase I)

    • रिप्लिकेशन (Replication) के दौरान ओकाज़ाकी फ्रेगमेंट (Okazaki fragments) को जोड़ने का काम करता है।

  2. डीएनए लिगेज़ II (DNA Ligase II)

    • कोशिका विभाजन के दौरान डीएनए की मरम्मत में सहायता करता है।

  3. डीएनए लिगेज़ III (DNA Ligase III)

    • डीएनए की मरम्मत (DNA Repair) में सहायक होता है।

  4. डीएनए लिगेज़ IV (DNA Ligase IV)

    • दोहरा धागा टूटने (Double-strand break repair) की प्रक्रिया में काम करता है, विशेष रूप से गैर-होमोलॉगस एंड जॉइनिंग (NHEJ) में।

डीएनए लिगेज़ कैसे काम करता है?

डीएनए लिगेज़ तीन चरणों में कार्य करता है:

  1. एडेनाइलेशन (Adenylation) – एंजाइम, एटीपी (ATP) या एनएडी+ (NAD+) के साथ मिलकर सक्रिय होता है।
  2. डीएनए सबस्ट्रेट की पहचान – यह टूटी हुई डीएनए स्ट्रैंड्स को पहचानता है।
  3. फॉस्फोडाइएस्टर बॉन्ड बनाना – यह दो डीएनए टुकड़ों को जोड़ने के लिए एक नया बॉन्ड बनाता है।

डीएनए लिगेज़ के अनुप्रयोग (Applications)

  1. जीन क्लोनिंग (Gene Cloning)

    • रिस्ट्रिक्शन एंजाइम द्वारा कटे हुए डीएनए टुकड़ों को जोड़ने के लिए प्रयोग किया जाता है।

  2. जीन थेरेपी (Gene Therapy)

    • आनुवंशिक बीमारियों के इलाज के लिए उपयोगी।

  3. डीएनए मरम्मत (DNA Repair)

    • कोशिकाओं में होने वाले डीएनए क्षति की मरम्मत करता है।

  4. रैपिड डीएनए एम्प्लीफिकेशन (Rapid DNA Amplification)

    • पीसीआर (PCR) और डीएनए अनुक्रमण में उपयोगी।


डीएनए पॉलिमरेज़ (DNA Polymerase) क्या है?

डीएनए पॉलिमरेज़ (DNA Polymerase) एक महत्वपूर्ण एंजाइम है जो डीएनए प्रतिकृति (DNA Replication) के दौरान नए डीएनए अणु (DNA strands) का संश्लेषण करता है। यह एंजाइम नए न्यूक्लियोटाइड्स (nucleotides) को जोड़कर डीएनए की प्रतिकृति (copy) बनाने का कार्य करता है।

डीएनए पॉलिमरेज़ के प्रकार

विभिन्न जीवों में डीएनए पॉलिमरेज़ के कई प्रकार होते हैं। बैक्टीरिया और यूकेरियोटिक कोशिकाओं में इनके अलग-अलग रूप पाए जाते हैं।

1. प्रोकेरियोटिक डीएनए पॉलिमरेज़ (Bacterial DNA Polymerase)

  • DNA Polymerase I
    • ओकाज़ाकी फ्रेगमेंट (Okazaki fragments) को जोड़ता है और डीएनए रिपेयर करता है।
    • इसमें 5' → 3' पॉलिमराइजेशन और 3' → 5' एक्सोन्यूक्लिएज़ (Proofreading) दोनों कार्य होते हैं।
  • DNA Polymerase II
    • डीएनए की मरम्मत (DNA Repair) में सहायता करता है।
  • DNA Polymerase III
    • डीएनए प्रतिकृति (Replication) का मुख्य एंजाइम।
    • यह नए डीएनए स्ट्रैंड का तेजी से संश्लेषण करता है।

2. यूकेरियोटिक डीएनए पॉलिमरेज़ (Eukaryotic DNA Polymerase)

  • DNA Polymerase α (Alpha)
    • प्राइमेज़ (Primase) के साथ मिलकर DNA रिप्लिकेशन की शुरुआत करता है।
  • DNA Polymerase β (Beta)
    • डीएनए की मरम्मत (Base excision repair) करता है।
  • DNA Polymerase δ (Delta)
    • लीडिंग और लैगिंग स्ट्रैंड का मुख्य डीएनए संश्लेषण करता है।
  • DNA Polymerase ε (Epsilon)
    • डीएनए प्रूफरीडिंग और उच्च-गुणवत्ता प्रतिकृति के लिए कार्य करता है।
  • DNA Polymerase γ (Gamma)
    • माइटोकॉन्ड्रिया में डीएनए प्रतिकृति करता है।

डीएनए पॉलिमरेज़ कैसे काम करता है?

  1. टेम्पलेट स्ट्रैंड (Template Strand) की पहचान करता है।
  2. नए न्यूक्लियोटाइड्स जोड़ता है, जिससे नया डीएनए बनता है।
  3. प्रूफरीडिंग (Proofreading) करता है और गलत न्यूक्लियोटाइड्स को हटाकर सही न्यूक्लियोटाइड जोड़ता है।
  4. ओकाज़ाकी फ्रेगमेंट्स को जोड़ने में मदद करता है (DNA Ligase के साथ मिलकर)।

डीएनए पॉलिमरेज़ के उपयोग (Applications)

  1. डीएनए अनुक्रमण (DNA Sequencing)
    • जीनोमिक अध्ययन और जीन विश्लेषण के लिए।
  2. पीसीआर (PCR - Polymerase Chain Reaction)
    • डीएनए के तेजी से प्रतिकृति के लिए।
  3. डीएनए मरम्मत (DNA Repair)
    • कोशिकाओं में डीएनए डैमेज को ठीक करता है।
  4. अनुवांशिक इंजीनियरिंग (Genetic Engineering)
    • जीन संशोधन और क्लोनिंग में उपयोग किया जाता है।

पॉलीन्यूक्लियोटाइड किनेज़ (Polynucleotide Kinase - PNK) क्या है?

पॉलीन्यूक्लियोटाइड किनेज़ (PNK) एक एंजाइम है जो डीएनए और आरएनए अणुओं के सिरों (ends) पर फॉस्फेट ग्रुप को स्थानांतरित (transfer) करता है। यह डीएनए और आरएनए की मरम्मत (repair), पुनर्संयोजन (recombination), और अनुक्रमण (sequencing) में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है।

PNK का मुख्य कार्य (Functions of Polynucleotide Kinase)

  1. 5'-फॉस्फेट जोड़ना (Phosphorylation of 5' Ends)

    • डीएनए और आरएनए के 5' हाइड्रॉक्सिल (-OH) ग्रुप को फॉस्फेट (-PO₄) ग्रुप में बदलता है।
    • यह लिगेशन (ligation) प्रक्रिया के लिए आवश्यक है।

  2. 3'-फॉस्फेट को हटाना (Dephosphorylation of 3' Ends)

    • डीएनए और आरएनए के 3' फॉस्फेट ग्रुप को हटाकर 3'-OH ग्रुप में बदलता है।

  3. डीएनए और आरएनए मरम्मत (DNA/RNA Repair)

    • यह टूटी हुई न्यूक्लियोटाइड श्रृंखलाओं (nucleotide strands) की मरम्मत में सहायक होता है।

  4. डीएनए क्लोनिंग और अनुक्रमण (DNA Cloning & Sequencing)

    • रेडियोएक्टिव या फ्लोरोसेंट लेबलिंग के लिए डीएनए को तैयार करने में मदद करता है।

PNK का उपयोग (Applications of Polynucleotide Kinase)

  1. डीएनए लिगेशन (DNA Ligation)
    • क्लोनिंग और जीन इंजीनियरिंग में, डीएनए लिगेज़ से पहले PNK का उपयोग किया जाता है।
  2. पीसीआर (Polymerase Chain Reaction - PCR)
    • डीएनए के सिरों को फॉस्फेट करने के लिए आवश्यक।
  3. डीएनए अनुक्रमण (DNA Sequencing)
    • न्यूक्लियोटाइड श्रृंखला की पहचान और विश्लेषण में सहायक।
  4. म्यूटेजेनेसिस (Mutagenesis) और जीन एडिटिंग (Gene Editing)
    • जीन परिवर्तन और संशोधन में मदद करता है।
  5. डीएनए क्षति की मरम्मत (DNA Damage Repair)
    • रेडिएशन या केमिकल्स से हुए डीएनए क्षति को ठीक करने में मदद करता है।

PNK कैसे काम करता है? (Mechanism of Action)

  1. ATP का उपयोग करता है – PNK, ATP से γ-फॉस्फेट ग्रुप लेकर डीएनए/आरएनए के 5' सिरों पर जोड़ता है।
  2. 3' फॉस्फेट को हटा सकता है – यह 3' फॉस्फेट को हटाकर 3'-OH बनाता है, जिससे आगे के संश्लेषण में मदद मिलती है।
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