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Electrophoresis

Definition of electrophoresis :-

वैद्युतकणसंचलन एक प्रयोगशाला तकनीक है जिसका उपयोग डीएनए, आरएनए या प्रोटीन अणुओं को उनके आकार और विद्युत आवेश के आधार पर अलग करने के लिए किया जाता है। एक जेल या अन्य मैट्रिक्स के माध्यम से अणुओं को स्थानांतरित करने के लिए विद्युत प्रवाह का उपयोग किया जाता है। जेल या मैट्रिक्स में छिद्र एक छलनी की तरह काम करते हैं, जिससे छोटे अणु बड़े अणुओं की तुलना में तेजी से आगे बढ़ते हैं। एक नमूने में अणुओं के आकार को निर्धारित करने के लिए, ज्ञात आकारों के मानकों को एक ही जेल पर अलग किया जाता है और फिर नमूने की तुलना में किया जाता है।

Electrophoresis Principle and its types:
आवेशित मैक्रोमोलेक्यूल्स को विद्युत क्षेत्र में उनके आवेश के आधार पर ऋणात्मक या धनात्मक ध्रुव की ओर ले जाया जाता है। न्यूक्लिक एसिड का ऋणात्मक आवेश होता है और इसलिए यह एनोड की ओर चला जाता है।

इस तकनीक को दो प्रकारों में बांटा गया है जैसे स्लैब वैद्युतकणसंचलन और केशिका वैद्युतकणसंचलन।

वैद्युतकणसंचलन के प्रकार:

1.केशिका वैद्युतकणसंचलन
     (1)जेल वैद्युतकणसंचलन
     (2)कागज वैद्युतकणसंचलन

2.स्लैब वैद्युतकणसंचलन
   (1)जोन वैद्युतकणसंचलन
   (2)इम्यूनोइलेक्ट्रोफोरेसिस                               (3)आइसोइलेक्ट्रोफोकसिंग

Gel electrophoresis procedure:
नीचे हमने डीएनए वैद्युतकणसंचलन के दौरान किए गए चरणों की व्याख्या की है।
      
              GEL ELECTROPHORESIS

चरण 1: नमूना तैयार करें –

डीएनए को अलग करें और नीली डाई डालकर घोल तैयार करें ताकि जेल में हो रहे नमूने की गति का निरीक्षण करना आसान हो जाए।

चरण 2: एक agarose TAE जेल समाधान तैयार करें -

टीएई बफर समाधान वैद्युतकणसंचलन की प्रक्रिया के दौरान एक विद्युत क्षेत्र उत्पन्न करने में मदद करता है। समाधान तैयार करने के लिए, उदाहरण के लिए, यदि 1% agarose जेल की आवश्यकता है तो 100mL TAE को 1 g agarose में जोड़ें। agarose का उच्च प्रतिशत एक सघन स्क्रीन देगा। agarose TAE सॉल्यूशन को गर्म करके agarose को घोलें।

चरण 3: जेल कास्टिंग -

agarose TAE घोल को कास्टिंग ट्रे में डालें। इसे ठंडा होने दें और जमने दें। कुओं के साथ एक जेल स्लैब प्रयोग के लिए तैयार है।

चरण 4: वैद्युतकणसंचलन कक्ष कैसे स्थापित करें?

टीएई बफर के साथ एक कक्ष भरें। ठोस जेल को कक्ष में रखें । जेल को ऐसी स्थिति में रखें कि वह नकारात्मक इलेक्ट्रोड के पास हो।

चरण 5: जेल लोडिंग -

कुओं को डीएनए नमूने और डीएनए सीढ़ी (आकार के लिए एक संदर्भ) के साथ लोड करें।

चरण 6: वैद्युतकणसंचलन की प्रक्रिया -

सकारात्मक और नकारात्मक बिंदुओं को बिजली की आपूर्ति और कक्ष से कनेक्ट करें। विद्युत क्षेत्र उत्पन्न होने के कारण डीएनए नमूने में शक्ति और प्रवासन पर स्विच करें। ऋणात्मक आवेशित नमूना धनात्मक बिंदु की ओर और ऋणात्मक इलेक्ट्रोड से दूर जाएगा ।

चरण 7: डीएनए का निरीक्षण करें -

एक बार जब आप जेल में नीले रंग के डीएनए नमूनों के प्रवास को देखते हैं तो बिजली की आपूर्ति बंद कर देते हैं। जेल निकालें और इसे एथिडियम ब्रोमाइड के घोल में रखें।

चरण 8: यूवी प्रकाश के तहत एथिडियम ब्रोमाइड दाग वाले जेल को बेनकाब करें और एक तस्वीर लें। डीएनए बैंड संबंधित कुएं की गली में दिखाई देते हैं। साथ ही, डीएनए सीढ़ी दिखाई दे रही है। इसलिए, डीएनए बैंड की लंबाई निर्धारित की जा सकती है। नीचे किए गए प्रयोग की छवि है।

Immunoelectrophoresis procedure:


1.इम्यूनोइलेक्ट्रोफोरेसिस प्रक्रिया:
     क्षैतिज स्थिति में कांच की स्लाइड पर                   agarose जेल तैयार करें।
2.नमूना टेम्पलेट का उपयोग करें और ध्यान से           कुओं को अनुप्रयोग क्षेत्र में ले जाएं।
3.पतला प्रोटीन समाधान के साथ 2:3 के               अनुपात में नमूना कमजोर पड़ने दें।
4.एक 5 μl पिपेट लें और प्रत्येक भट्ठा में नमूना       और नियंत्रण के 5 μl जोड़ें।
5.कैथोड पक्ष के पास नमूना स्थिति                       वैद्युतकणसंचलन के लिए कक्ष में जेल रखें।         100 वोल्ट पर 20 मिनट के लिए                    वैद्युतकणसंचलन को अंजाम दें।
6.एक गर्त में एंटीसेरम के 20 μl लें और                 वैद्युतकणसंचलन प्रतिस्पर्धा पर कमरे के                तापमान पर 8- 20 घंटे के लिए सेते हैं।
7.agarose gel को 10 मिनट के लिए                    सलाइनसॉल्यूशन में भिगोएँ, सुखाएँ और             दो बार धो लें।
8.जेल को 70 डिग्री सेल्सियस से नीचे सुखाएं          और प्रोटीन स्टेन सॉल्यूशन से 3 मिनट के           लिए दाग दें। 5 मिनट के लिए डेस्टिनेशन             सॉल्यूशन में जेल को रंग दें।
9. जेल सूख जाने के बाद परिणाम निर्धारित करें
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Southern blotting technique (सदर्न ब्लोटिंग)

सदर्न ब्लोटिंग( Southern blotting )
       इस प्रविधि में DNA प्रतिदर्श (Sample) का पाचन प्रतिबंध एंजाइम (restriction enzyme) द्वारा किया जाता है इस पते हुए प्रतीदर्श का जेल इलेक्ट्रोफॉरेसिस किया जाता है। जेल (gel) मे DNA बेणड्स (bands) क्षारीय विलायक ( alkaline solution ) की सहायता से एकल स्ट्रेंडस (single strands) मे विकृत (denatured) हो जाते हैं इसके साथ-साथ बफर संतृप्त फिल्टर पेपर के शीर्ष (top) पर जेल (gel) को लिटाकर (laid) क्लच प्लेट पर रख दिया जाता है। जिससे इसके दोनों किनारे (ends) बफर में डूबे रहते हैंं। जेल के शीर्ष (top) पर नाइट्रोसेल्यूलोज कला की चादर (sheet) सेक्स दी जाती है। और इस कला के शीर्ष पर अनेक कागजों का स्तंभ (stack)  रख दिया जाता है। कागजों के स्तंभ (stack) के शीर्ष पर 0.5 किलोग्राम का भार रख दिया जाता है। फिल्टर पेपर वीक (wick) की सहायता से बफर विलियन (buffer solution) को ऊपर की ओर खींच लिया जाता है। जो जेल से होकर  नाइट्रोसेल्यूलोज कला में गुजरता है। और अंत में कागज स्तंभ (stacks) मैं पहुंच जाता है। जेल से गुजरते समय बफर अपने साथ एक स्ट्रैंड वाला (single stranded) DNA ले जाता है। जो नाइट्रोसेल्यूलोज कला द्वारा बंधित हो जाता है।

 dig. Southern blotting technique

       यह क्रिया तब होती है जबकि बफर (buffer) कागज के स्तंभ (stacks) द्वारा गुजरता है। इस विन्यास को एक रात्री (over night) के लिए रख दिया जाता है। और पेपर टॉवेल्स (paper towels) को प्रथक करके नष्ट (discard)  कर दिया जाता है। इस पर एकल स्ट्रैंडेड DNA बैंड्स के साथ नाइट्रोसेल्यूलोज कला ब्लोटेड (blotted) हो जाते हैं। जिसे 80⁰C पर 2 - 3 घंटे गर्म करते हैं। जिससे DNA कला पर स्थाई रूप से फिक्स हो जाते हैं। यह कला एग्रोस जेल से DNA बैंड्स के प्रतिकृति (replica) प्रदर्शित करते हैं। और इसे संकरण के लिए रेडियोएक्टिवली लेविल्ड DNA अथवा RNA शलाका के रूप में प्रयोग किया जा सकता है। अबंधित (unbound) DNA को हटाने के लिए कला को धोया जाता है। तथा संकरण कृत कला को X - ray द्वारा उपचारित करके जेल इलेक्ट्रोफॉरेसेज प्राप्त कर लिया जाता है। सदर्न ब्लोटिंग के इन सभी पदों को दर्शाया गया है।
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